【CEM】寵物食品中牛磺酸含量的快速制備

一、引言

寵物通常被視為我們直系家庭中毛茸茸的（有鱗、有羽毛等）成員，在現(xiàn)代生活中扮演著重要角色。寵物用品從加熱床到專業(yè)美容服務(wù)應(yīng)有盡侑，因此它們的飲食受到更嚴(yán)格的審查也就不足為奇了。狗糧形式多樣，不同食譜對(duì)健康有益也有風(fēng)險(xiǎn)。近來(lái)，無(wú)谷物或富含豆類的飲食因其與犬類心臟病——擴(kuò)張型心肌病（DM）之間的聯(lián)系而受到質(zhì)疑，這種疾病可導(dǎo)致充血性心力衰竭，最終可能導(dǎo)致死亡。DM是由于缺乏牛磺酸引起的，因此狗的飲食必須含有足量的牛磺酸。

在本研究中，使用Discover Prep™系統(tǒng)水解狗糧樣本，以將氨基酸從其結(jié)合的蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)。與傳統(tǒng)的水解技術(shù)相比，Discover Prep利用微波進(jìn)行樣本水解，將技術(shù)的時(shí)間框架從24小時(shí)縮短至不到一小時(shí)。水解后，樣本被中和，并使用Waters AccQ-Tag®試劑盒測(cè)量氨基酸含量。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)方法相比，Discover Prep能夠迅速且準(zhǔn)確地從寵物食品中的蛋白質(zhì)水解出牛磺酸，具有很好的精確度。無(wú)谷物狗糧和含谷物狗糧樣本的牛磺酸含量進(jìn)行了比較。對(duì)于實(shí)驗(yàn)室量化狗糧中的牛磺酸和其他氨基酸而言，Discover Prep是一個(gè)理想的選擇。

二、材料與方法

試劑和樣品

所有試劑均購(gòu)自商業(yè)供應(yīng)商。所有狗糧樣品均從當(dāng)?shù)貙櫸镉闷返曩?gòu)買。所有狗糧樣品均使用商用廚房攪拌機(jī)研磨。選擇這些狗糧是因?yàn)樗鼈兊闹饕鞍踪|(zhì)成分不同，并且標(biāo)稱含有高含量的牛磺酸。分析了三個(gè)樣品：樣品1是三文魚(yú)、紅薯和南瓜配方，樣品2是雞肉和紅薯配方，樣品3是火雞和燕麥配方。水解溶液在使用前新鮮制備。

狗糧樣品使用CEM Discover Prep系統(tǒng)進(jìn)行水解。通過(guò)柱前衍生化測(cè)定水解產(chǎn)物的氨基酸含量，然后通過(guò)UPLC^®注射和在260 nm下的PDA檢測(cè)進(jìn)行分析。使用Waters AccQ-Tag Ultra衍生化試劑盒對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行LC-PDA分析。Discover Prep樣品制備的結(jié)果與傳統(tǒng)烤箱法及營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽進(jìn)行了比較。

Discover Prep樣品制備

將100毫克狗糧樣品加入裝有攪拌棒的35 mL Discover Pyrex^®小瓶中。記錄質(zhì)量以供分析。對(duì)于酸性水解，向每個(gè)小瓶中加入5毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹掃1分鐘，然后迅速蓋上蓋子。樣品按以下Discover Prep方法運(yùn)行：

酸性水解

小瓶類型：Pyrex

控制類型：動(dòng)態(tài)

溫度：160 °C

時(shí)間：30分鐘

壓力：300 PSI

功率：300 W

攪拌：高

傳統(tǒng)水解樣品制備

將40毫克狗糧樣品加入適當(dāng)?shù)牟Ａ∑恐小Ｓ涗涃|(zhì)量以供分析。對(duì)于酸性水解，向每個(gè)小瓶中加入2毫升含1%苯酚的6 N HCl。所有小瓶用N₂吹掃1分鐘，然后迅速蓋上蓋子。然后將小瓶放入設(shè)定為110 °C的空氣烘箱中24小時(shí)。

水解后樣品制備和衍生化分析

酸性水解樣品用6 N NaOH中和，并用0.26 µm PTFE注射器過(guò)濾器過(guò)濾。中和后，樣品用Waters AccQ-Tag試劑盒進(jìn)行衍生化。向一個(gè)完整的回收小瓶中加入80 µL來(lái)自Waters AccQ-Tag Ultra衍生化試劑盒的硼酸緩沖液。然后，加入10 µL樣品并蓋緊蓋子渦旋。接著，向每個(gè)樣品反應(yīng)中加入10 µL準(zhǔn)備好的衍生化試劑。最后，將反應(yīng)渦旋10秒鐘，然后在55 °C下加熱10分鐘進(jìn)行分析。

分析

每個(gè)衍生化反應(yīng)取1 μL樣品注入Waters AccQ-Tag Ultra C18柱（1.7 μm, 2.1 x 100 mm），該柱連接到帶有Waters PDA檢測(cè)器的Waters ACQUITY™ H-Class UPLC^®。流速設(shè)定為0.4 mL/min。柱溫保持在55 °C，吸收波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)在260 nm。用于分離的洗脫梯度如表1所示。流動(dòng)相為A: Milli-Q^®水中稀釋10倍的Waters AccQ-Tag洗脫液A和B: Waters AccQ-Tag洗脫液B。為了每種氨基酸創(chuàng)建校準(zhǔn)曲線，使用Waters Amino Acid Food and Feed Standard Kit（Waters Corporation, SKU. 186009299）進(jìn)行衍生化，濃度分別為1, 5, 10, 25, 和50 pmol/μL。采用線性回歸法分析樣品。

表1. 衍生化氨基酸分離所用梯度

三、結(jié)果

圖1. Discover Prep水解中回收的牛磺酸量

圖2. 從狗糧中回收的氨基酸量

四、結(jié)論

Discover Prep微波反應(yīng)系統(tǒng)成功水解了寵物食品中的氨基酸，并產(chǎn)生了與傳統(tǒng)烘箱水解相似的結(jié)果。在比較氨基酸含量時(shí)，傳統(tǒng)烘箱水解和Discover水解的結(jié)果%RSD均小于10%。在比較狗糧的牛磺酸含量時(shí)，樣品1的含量最高，其次是樣品2和樣品3。