【ISCO】波段收集技術(shù)在CombiFlash®系統(tǒng)中的應(yīng)用

一、摘要

波段收集技術(shù)通過觀測用戶自訂的吸光波段來凈化化合物。數(shù)據(jù)以單一軌跡形式展示，以便于實現(xiàn)更有效的分析收集。此外，應(yīng)用信號處理技術(shù)可消除由于溶劑吸收紫外線導(dǎo)致的基線漂移現(xiàn)象。

二、概述

CombiFlash系統(tǒng)中波段收集功能能夠計算光電二極管陣列檢測到的所有波長的平均吸光度。通過對信號進行處理，可以消除由溶劑吸收引起的基線漂移現(xiàn)象。這樣便產(chǎn)生了一個單一的圖譜或是色譜信號，使得多功能液相色譜或快速色譜系統(tǒng)中的分部收集程序能夠精確地收集以純化產(chǎn)物。在以下情況下，波段檢測顯得尤為重要：

n化合物或是分析物光譜未知時，例如從自然產(chǎn)品中提取的化合物。

n當(dāng) 一混合物包含多種不同的吸光度的混合物，單一波長無法識別混合物中所有化合物時。

n當(dāng)洗脫溶劑的吸收光譜與所需化合物的吸收光譜重疊時。

n當(dāng)具有相似光譜的化合物使檢測器過載，從而難以正確分離化合物時。

CombiFlash系統(tǒng)的波段檢測技術(shù)顯著提升了自動化提純化合物的能力。以下是幾個示例以說明這些技術(shù)改進的優(yōu)勢。

示例1：(化合物)混合物

示例2：未知光譜

圖3：圖2中分離的化合物的紫外吸收圖譜。

在圖2中，大部分兒茶素家族化合物不吸收254nm波長的紫外線，但波段收集技術(shù)卻能夠成功檢測并分離該族化合物。這一技術(shù)手段在處理自然產(chǎn)物時顯得特別有效，因為在進行最終純化之前，我們通常無法了解目標(biāo)化合物的吸光度情況。通常完成分子鑒定之前，我們尚未了解某特定分子的吸光度。波段收集技術(shù)特別適純化吸收光譜未知的化合物，因此此技術(shù)在處理天然物顯得特別有效。

溶劑光譜與化合物光譜重疊

乙酸乙酯和二氯甲烷是快速色譜中常用的兩種溶劑。它們都能吸收250 nm以下的紫外光，這會干擾在此波長范圍內(nèi)同樣具有吸收能力的化合物的檢測，特別是在使用梯度洗脫時尤為明顯。這種不斷變化的基線也會妨礙分部收集器準(zhǔn)確切割分部的能力。

圖4：使用二氯甲烷/甲醇梯度，通過波段收集技術(shù)純化葡萄糖五乙酸酯。

葡萄糖五乙酸酯在210nm波長的吸光能力較弱，在圖譜上其吸收更進一步被二氯甲烷影響，因二氯甲烷也會吸收210波長（參見圖4）。當(dāng)二氯甲烷的濃度降低時，基線會向下漂移。這種漂移通常會干擾傳統(tǒng)的分部收集程序，但在波段收集技術(shù)面前，這并不是問題。波段收集能夠有效地濾除基線漂移，從而為CombiFlash系統(tǒng)中的分部收集器提供一個穩(wěn)定的基線。

樣品過載檢測器

在快速色譜中，樣品負(fù)載過高導(dǎo)致吸光度飽和檢測器是常見情況。若化合物洗脫時間相近，這種飽和現(xiàn)象會使得分部收集器無法準(zhǔn)確分離化合物，因為飽和峰會被誤認(rèn)為一個大的單一峰。

圖5：使用波段收集技術(shù)純化緊密洗脫的飽和峰。

波段收集技術(shù)能夠測量用戶選定光譜范圍內(nèi)的平均吸光度，因得以觀測到未飽和的光譜，我們進而得以精準(zhǔn)切割分析物的吸收峰。在圖5中，通過波段收集技術(shù)成功純化了過載且重疊的兒茶酚和間苯二酚峰。

純化具有相同特性吸收峰的多種化合物

由于波段收集技術(shù)的檢測范圍可以調(diào)節(jié)， 使用者可以輕松分離出具有特殊吸收波段的那些化合物。這項技術(shù)允許僅僅收集我們感興趣的特定化合物。雖然我們可以選擇一個單一波長來完成這項任務(wù)，但波段收集技術(shù)可以設(shè)定一個特定的波長范圍，以收集一系列結(jié)構(gòu)相近的化合物。

圖6: 單一波長技術(shù)可分辨三種吸收254紫外光的化合物。而圖7則展示了利用波段收集技術(shù)進行選擇性純化的過程，其中化合物1和3在295 nm至325 nm的波長范圍內(nèi)有吸收而化合物2不吸收該波段波長。

圖6：在254 nm處純化化合物。

圖7：運用波段收集，在295至325 nm區(qū)間內(nèi)選擇性提純化合物。

三、波段收集技術(shù)參數(shù)設(shè)置建議

波段收集技術(shù)的參數(shù)設(shè)置位于CombiFlash系統(tǒng)的方法編輯器界面。啟動波段收集功能后，便可配置檢測器的各項參數(shù)（參見圖8）。可配置的參數(shù)包括波長范圍（用以濾除溶劑或非目標(biāo)化合物）、峰寬度、斜率以及閾值。當(dāng)波長范圍包含無吸光度的區(qū)域雖然會降低波段收集的靈敏度，但依舊能夠?qū)崿F(xiàn)化合物的收集。

此外，使用波段收集時，建議同時啟用一個可以觀測到大多數(shù)分析物（包含雜質(zhì)）吸收光譜的單一檢測器。

圖8：波段收集和單一波長收集的檢測參數(shù)。

四、波段收集技術(shù)參數(shù)示例

案例1：溶劑在偵測波長范圍內(nèi)無吸收

若選定波長范圍內(nèi)溶劑無吸收，可將峰寬設(shè)為最長八分鐘。這一設(shè)置同樣適用于等度洗脫，因基線穩(wěn)定，即使溶劑吸光度落在波段收集選定范圍內(nèi)，仍適用此設(shè)置。圖1展示了按此技術(shù)進行純化的情形。

案例2：溶劑在波長范圍內(nèi)有吸收

如溶劑在選定檢測器范圍內(nèi)吸收（參見圖4），則需將波段收集的峰寬設(shè)置為單一波長檢測器峰寬的兩倍。參見圖8示例。此參數(shù)有助于減少溶劑干擾（參見圖9和圖10）。

圖9：使用庚烷：丙酮梯度在280 nm收集兒茶酚和間苯二酚。基線隨著丙酮比例的增加而漂移。

圖10：使用波段收集技術(shù)在庚烷：丙酮梯度中收集兒茶酚和間苯二酚。波段收集技術(shù)過濾掉了大部分基線漂移。

五、結(jié)論

波段收集技術(shù)對于純化未知吸光度或被溶劑掩蓋吸光度的化合物木及具價值。該技術(shù)能夠有效分離那些吸光度超出檢測器承載范圍的峰，從而提升了CombiFlash系統(tǒng)的自動化和無人值守操作特性。